Purificación de la enzima hidroperóxido liasa y producción del sustrato, utilizando amaranthus hybridus l

Abstract

En el presente trabajo la enzima hidroperóxido liasa (HPL) fue extraída a partir de las hojas de quintoniles (Amaranthus hybridus L.) y se purificó evaluando tres etapas cromatográficas; cromatografía de intercambio iónico (TOYOPEARL DEAE-650M), de interacción hidrofóbica (fenil sefarosa) y de hidroxiapatita. Se determinó la actividad enzimática, concentración de proteína por el método de Bradford, el peso molecular aproximado de la enzima HPL por electroforesis SDS-PAGE y se evaluó la utilización de la técnica de UPLCQTof para determinar el peso molecular exacto de la enzima. Se realizó la obtención de extractos de ácidos grasos mediante la extracción con fluidos supercríticos (EFS) estos ácidos grasos se utilizaron para obtener el sustrato de la enzima HPL. Finalmente, se implementó la técnica de PCR en el material genético obtenido de las hojas de los quintoniles. Se encontró que la enzima se purificó 61.8 veces en una sola etapa de purificación, presentando una actividad enzimática específica de 2045.26 U/mg de proteína y un peso molecular aproximado de 59 kDa. Con el método de UPLC-QTof no se logró determinar el peso molecular exacto debido a las interferencias del detergente, Tritón X-100, presente en las muestras. La actividad enzimática incrementó 21.2 % al utilizar el sustrato obtenido a partir de los extractos de EFS. La extracción de ADN obtenido de las hojas frescas de quintoniles fue de 6656.5 ng/µL. Al introducir el diseño de oligonucleótidos obtenido a partir del material genético de la enzima HPL reportado en la literatura, en el programa Primers-BLAST, alinearon de forma correcta. En base a los resultados obtenidos en el presente trabajo se puede concluir que la enzima HPL extraída de las hojas de quintoniles se puede purificar parcialmente con la primera etapa de purificación, además, los sustratos obtenidos a partir de la oxidación de los extractos de EFS son adecuados para la enzima HPL.